Mae IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) yn analog o swbstrad β-galactosidase, sy'n hynod ysgogadwy. O dan ysgogiad IPTG, gall yr ysgogydd ffurfio cymhlyg gyda'r protein atalydd, fel bod cyfluniad y protein atalydd yn newid, fel na ellir ei gyfuno â'r genyn targed, a bod y genyn targed yn cael ei fynegi'n effeithlon. Felly sut y dylid pennu crynodiad IPTG yn ystod yr arbrawf? Ai po fwyaf, y gorau?
Yn gyntaf, gadewch i ni ddeall egwyddor ysgogi IPTG: mae operon (elfen) lactos E. coli yn cynnwys tair genyn strwythurol, Z, Y, ac A, sy'n amgodio β-galactosidase, permease, ac asetyltransferase, yn y drefn honno. Mae lacZ yn hydrolysu lactos yn glwcos a galactos, neu'n allo-lactos; mae lacY yn caniatáu i lactos yn yr amgylchedd basio trwy'r bilen gell a mynd i mewn i'r gell; mae lacA yn trosglwyddo'r grŵp asetyl o asetyl-CoA i β-galactosid, sy'n cynnwys cael gwared ar effaith wenwynig. Yn ogystal, mae dilyniant gweithredu O, dilyniant cychwyn P a genyn rheoleiddio I. Mae cod y genyn I yn brotein atalydd a all rwymo i safle O'r dilyniant gweithredwr, fel bod yr operon (meta) yn cael ei atal a'i ddiffodd. Mae yna hefyd safle rhwymo ar gyfer safle rhwymo protein actifadwr genyn catabolaidd - CAP i fyny'r afon o'r dilyniant cychwyn P. Mae'r dilyniant P, dilyniant O a safle rhwymo CAP gyda'i gilydd yn ffurfio rhanbarth rheoleiddio'r operon lac. Mae genynnau codio'r tri ensym yn cael eu rheoleiddio gan yr un rhanbarth rheoleiddio i gyflawni mynegiant cydlynol cynhyrchion genynnau.
Yn absenoldeb lactos, mae'r operon lac (meta) mewn cyflwr o ataliad. Ar yr adeg hon, mae'r atalydd lac a fynegir gan y dilyniant I o dan reolaeth y dilyniant hyrwyddwr PI yn rhwymo i'r dilyniant O, sy'n atal polymeras RNA rhag rhwymo i'r dilyniant P ac yn atal cychwyn trawsgrifio; pan fydd lactos yn bresennol, gellir ysgogi'r operon lac (meta). Yn y system operon (meta) hon, nid lactos ei hun yw'r ysgogydd go iawn. Mae lactos yn mynd i mewn i'r gell ac yn cael ei gatalyddu gan β-galactosidase i'w drawsnewid yn allolactos. Mae'r olaf, fel moleciwl ysgogydd, yn rhwymo i'r protein atalydd ac yn newid cyfluniad y protein, sy'n arwain at ddatgysylltiad y protein atalydd o'r dilyniant O a thrawsgrifio. Mae gan Isopropylthiogalactoside (IPTG) yr un effaith ag allolactos. Mae'n ysgogydd pwerus iawn, nad yw'n cael ei fetaboleiddio gan facteria ac mae'n sefydlog iawn, felly fe'i defnyddir yn helaeth mewn labordai.
Sut i benderfynu ar y crynodiad gorau posibl o IPTG? Cymerwch E. coli fel enghraifft.
Cafodd y straen E. coli BL21 a beiriannwyd yn enetig yn cynnwys y pGEX ailgyfunol positif (CGRP/msCT) ei frechu i gyfrwng hylif LB yn cynnwys 50μg·mL-1 Amp, a'i ddiwyllio dros nos ar 37°C. Cafodd y diwylliant uchod ei frechu i 10 potel o gyfrwng hylif LB ffres 50mL yn cynnwys 50μg·mL-1 Amp ar gymhareb o 1:100 ar gyfer diwylliant ehangu, a phan oedd y gwerth OD600 yn 0.6~0.8, ychwanegwyd IPTG at y crynodiad terfynol. Mae'n 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. Ar ôl ei sefydlu ar yr un tymheredd a'r un amser, cymerwyd 1 mL o'r toddiant bacteriol ohono, a chasglwyd y celloedd bacteriol trwy allgyrchu a'u rhoi dan SDS-PAGE i ddadansoddi dylanwad gwahanol grynodiadau IPTG ar fynegiant protein, ac yna dewis y crynodiad IPTG gyda'r mynegiant protein mwyaf.
Ar ôl arbrofion, canfyddir nad yw crynodiad IPTG mor fawr â phosibl. Mae hyn oherwydd bod gan IPTG rywfaint o wenwyndra i facteria. Bydd mynd y tu hwnt i'r crynodiad hefyd yn lladd y gell; ac yn gyffredinol, rydym yn gobeithio po fwyaf o brotein hydawdd a fynegir yn y gell, y gorau, ond mewn llawer o achosion pan fydd crynodiad IPTG yn rhy uchel, bydd llawer iawn o gynhwysiant yn cael ei ffurfio. Corff, ond mae faint o brotein hydawdd yn lleihau. Felly, yn aml nid yw'r crynodiad IPTG mwyaf addas po fwyaf y gorau, ond po isaf y crynodiad.
Pwrpas ysgogi a thyfu straenau a beiriannwyd yn enetig yw cynyddu cynnyrch y protein targed a lleihau costau. Nid yn unig y mae ffactorau'r straen ei hun a'r plasmid mynegiant yn effeithio ar fynegiant y genyn targed, ond hefyd gan amodau allanol eraill, megis crynodiad yr ysgogiad, y tymheredd ysgogi a'r amser ysgogi. Felly, yn gyffredinol, cyn mynegi a phuro protein anhysbys, mae'n well astudio'r amser ysgogi, y tymheredd a chrynodiad IPTG er mwyn dewis yr amodau priodol a chael y canlyniadau arbrofol gorau.
Amser postio: 31 Rhagfyr 2021