Mae dithiothreitol (DTT) yn asiant lleihau a ddefnyddir yn gyffredin, a elwir hefyd yn ychwanegyn gwyrdd newydd. Mae'n gyfansoddyn organig moleciwlaidd bach gyda dau grŵp mercaptan (-SH). Oherwydd ei briodweddau lleihau a'i sefydlogrwydd, defnyddir DTT yn helaeth mewn arbrofion biocemeg a bioleg foleciwlaidd.
Prif rôl DTT yw lleihau bondiau disulfid mewn proteinau a biofoleciwlau eraill. Mae'r bond disulfid yn rhan bwysig o blygu a sefydlogrwydd proteinau, ond o dan rai amodau arbrofol, megis dadansoddiad SDS-PAGE lleihaadwy, ailgyfuno a phlygu proteinau, mae angen lleihau'r bond disulfid i ddau grŵp thiol i ddatod strwythur gofodol y protein. Gall DTT adweithio â bondiau disulfid i'w lleihau i grwpiau mercaptan, gan agor strwythur gofodol y protein a'i gwneud hi'n hawdd ei ddadansoddi a'i drin.
Gellir defnyddio DTT hefyd i amddiffyn gweithgaredd a sefydlogrwydd ensymau. Mewn rhai adweithiau a gatalyddir gan ensymau, gall gweithgaredd yr ensym gael ei leihau gan yr ocsidydd. Gall DTT adweithio ag ocsidyddion i'w lleihau i sylweddau diniwed, a thrwy hynny amddiffyn gweithgaredd a sefydlogrwydd yr ensym.
O'i gymharu ag asiantau lleihau traddodiadol fel β-mercaptoethanol (β-ME), ystyrir bod DTT yn asiant lleihau mwy diogel a sefydlog. Nid yn unig y mae'n sefydlog mewn toddiant dyfrllyd, ond mae hefyd yn cynnal ei briodweddau lleihau o dan amodau tymheredd uchel ac asid-bas.
Mae defnyddio DTT yn gymharol syml. Yn gyffredinol, mae DTT yn cael ei doddi mewn byffer priodol ac yna'n cael ei ychwanegu at y system arbrofol. Mae angen pennu'r crynodiad gorau posibl o DTT yn ôl yr arbrawf penodol, ac fe'i defnyddir yn gyffredinol yn yr ystod o 0.1-1mM. Gall crynodiadau is leihau effeithiau andwyol ar dwf celloedd a gallant leihau cytotocsinedd oherwydd gorfynegiant proteinau targed. Gall crynodiadau uwch achosi baich metabolaidd gormodol ar gelloedd, gan effeithio ar dwf celloedd ac effeithlonrwydd mynegiant.
Y ffordd o bennu'r crynodiad gorau posibl yw gwerthuso lefel mynegiant y protein targed trwy gynnal profion sefydlu IPTG ar wahanol grynodiadau. Gellir cynnal profion diwylliant ar raddfa fach gan ddefnyddio ystod o grynodiadau IPTG (e.e. 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, ac ati) a gellir gwerthuso'r effaith mynegiant ar wahanol grynodiadau trwy ganfod lefel mynegiant y protein targed (e.e. Western blot neu ganfod fflwroleuedd). Yn ôl y canlyniadau arbrofol, dewiswyd y crynodiad gyda'r effaith mynegiant orau fel y crynodiad gorau posibl.
Yn ogystal, gallwch hefyd gyfeirio at y llenyddiaeth berthnasol neu brofiad labordai eraill i ddeall yr ystod crynodiad IPTG a ddefnyddir yn gyffredin o dan amodau arbrofol tebyg, ac yna optimeiddio ac addasu yn ôl yr anghenion arbrofol.
Mae'n bwysig nodi y gall y crynodiad gorau posibl amrywio yn dibynnu ar wahanol systemau mynegiant, proteinau targed ac amodau arbrofol, felly mae'n well optimeiddio fesul achos.
I grynhoi, mae DTT yn asiant lleihau a ddefnyddir yn gyffredin y gellir ei ddefnyddio i leihau bondiau disulfide mewn proteinau a biofoleciwlau eraill ac i amddiffyn gweithgaredd a sefydlogrwydd ensymau. Fe'i defnyddiwyd yn helaeth mewn arbrofion biocemeg a bioleg foleciwlaidd.
Amser postio: Medi-28-2023